作者：Jana Rousova Hepner 博士、Kristi Sellers 、Hansjörg Majer 博士和 Joe Konschnik
摘要
食用油中的 3-MCPD 和缩水甘油酯是精炼过程形成的污染物，已被列为可能的人类致癌物。ISO、AOCS 和 DGF 已开发出多种分析 3-MCPD 和缩水甘油酯的方法。虽然这些方法详细介绍了萃取和衍生化技术，但很少有人注意到 GC-MS 分析方法。随着新出现的自动化系统简化了样品制备工作流程，通过优化方法条件和进样技术来简化和加速分析非常重要。我们对 GC 柱温箱温度程序的初始优化让分析时间缩短了 8 分钟，另外，使用免费方法开发软件（Pro EZGC 色谱图建模器）还可以节省更多的时间。当前发表的方法建议使用分流/不分流或 PTV 进样口，两者都在不分流模式下运行。我们研究了分流进样，观察到峰形改进，这一点在我们的意料之中。然而，与不分流进样相比，分流进样技术也达到了相似的检测限，这与对两种技术的典型预期相反。
引言
3-单氯丙二醇（3-MCPD）酯是各种精炼油中发现的污染物，是在高温脱臭过程中，在氯化物存在下，由天然酰基甘油形成的[1]。各种精炼油中 3-MCPD 酯的浓度不同，棕榈油和核桃油中 3-MCPD 酯的含量最高。动物实验表明，3-MCPD 酯在胃肠道中水解生成具有毒性的游离 3-MCPD。大鼠和小鼠的肾脏和雄性生殖器官是主要的毒性作用靶点 [2]。缩水甘油酯也是精炼油中的污染物，但其生成过程与 3-MCPD 酯不同 [3]。缩水甘油酯是由二酰甘油在高温 (>240 °C) 下形成的，反应发生时不需要有氯化物存在。它们在被食用后的命运与 3-MCPD 酯相似——也就是，在胃肠道中被水解成缩水甘油。动物实验表明，缩水甘油具有遗传毒性和致癌性。这些化合物的化学结构如图 1 所示。
随着食品工业对部分氢化油失去了兴趣，反式脂肪酸也不再是重点研究领域。现在，重点领域是油精炼的副产品。3-MCPD和缩水甘油酯 (GE) 是可疑致癌物，虽然美国食品和药物管理局 (FDA) 没有对此设限，但欧洲食品安全局 (EFSA) 已经规定 3-MCPD 的每日可耐受摄入量为 2μg/kg（按体重） [4]。欧盟 (EU) 认为，对于某些选择的未精炼油和精炼油，如橄榄油（不含渣油）、葵花籽油、大豆油和棕榈仁油，3-MCPD 酯的最高限值为 1.25mg/kg，对于其他精炼植物油、水产动物油和鱼油，3-MCPD 酯的最高限值为 2.5mg/kg [5]。
MCPD 酯和缩水甘油酯的异构体分析可以通过两种方法实现：直接和间接。直接方法通常涉及 LC-MS 系统，它可提供有关样品组成的完整信息，而 MCPD 或缩水甘油酯没有任何化学转化。在没有酯交换步骤的情况下，应当不会有 MCPD 酯转化为缩水甘油酯，反之亦然，尽管需要去除三酰甘油的高背景以防止这些干扰造成低估目标化合物。在此步骤中必须小心，以确保样品净化程序不会同时去除 MCPD 和缩水甘油酯。此外，精确定量需要单独的酯标准品，并且它们的测定需要高度灵敏的仪器，例如高分辨 MS 仪器。
第二种方法是间接分析。这种方法更适合于常规分析，因为它需要的标准品要少得多，而且样品制备可以自动化。其中包括分析食用油中 MCPD 和缩水甘油酯的三种 AOCS 方法（Cd 29a-13、Cd 29b-13 和 Cd 29c-13）。这三种方法都遵循相似的轨迹：酯交换将三酰甘油转化为脂肪酸甲酯 (FAME)；酯交换产生的碱性条件的中和；作为净化步骤，萃取 FAME。萃取游离 MCPD和缩水甘油[根据选择的具体方法转化为 MCPD 或溴化丙二醇 (MBPD)]，然后用苯硼酸 (PBA) 衍生化，以提高分析物的挥发性，使其更适合 GC 分离和 MS 或 MS/MS 分析。虽然这些方法详细介绍了样品处理过程，但对 GC-MS 分析方法的关注很少。新兴的样品制备自动化系统正在帮助简化样品制备。分析方法也可以优化，以提高整体性能。例如，AOCS 方法有机会优化柱温箱温度程序从而加速分析，虽然这可能无法最终提高样品通量，因为即使是自动化样品制备过程也可能比分析本身花费更长的时间，但是它确实提供了机会在分析之间更彻底地调节色谱柱或在分析之间方便地采取节约成本的措施，如减少气体流量。
除了柱温箱温度程序外，还研究了进样技术，目的是证明分流进样是否能产生可接受的结果。通常，各方法要求使用不分流进样，方式是通过分流/不分流进样口或程序升温汽化(PTV) 进样口；然而，通过采用分流进样，特别是对于需要分析物衍生化的样品制备方法，可以显著减少转移到色谱柱中的衍生化试剂的量，从而可潜在增加色谱柱寿命。
我们对在不同温度下使用两种不同进样口（PTV 和分流/不分流）以及两种进样模式（分流和不分流）的情况进行了评估。方法性能评估基于仪器检测限 (LOD) 和通过校准曲线斜率测得的方法灵敏度。
实验化学品和材料LC-MS 级溶剂购自 Fisher Scientific。乙醚、游离 3-MCPD、甲醇钠（25%，甲醇溶液）、氢氧化钠、氯化钠、溴化钠、硫酸
（25%）、正磷酸（85%）、苯硼酸购自 Sigma Aldrich。游离 2-MCPD、2-MCPD-d5以及缩水甘油-d5硬脂酸酯购自 TorontoResearch Chemicals。3-MCPD 二棕榈酸酯、3-MCPD-d5二棕榈酸酯和硬脂酸缩水甘油酯的溶液是定制标准品，由 Restek 公司提供。标准品贮存于 -20°C 温度之下。为了分析时能提供一个空白基质，从一家当地杂货店购买了特级初榨橄榄油 (EVOO)，并在室温下于暗处贮存。
样品制备
定制的 Restek 标准液与利用纯净材料制备的溶液一起用作工作溶液。校准标准品（3-MCPD 酯或缩水甘油酯）在油中的浓度范围为 0.002–12 mg/kg。
随后使用修改版 AOCS 方法 Cd 29b-13 和 Cd 29c-13 制备强化 EVOO 样品以供分析（方法 Cd 29c-13 的构架如图 2 所示）。对已发表方法的修改主要是为了减少溶剂用量。两种方案中的油样均溶于甲基叔丁基醚（取代了方法 CD29B-13 中的乙醚）。在第二次萃取步骤（图 2）中，乙醚/乙二醇二乙酸酯的量减少到每次萃取时 500μL（总共 1.5mL）。用于定性目的的样品留在乙醚/乙二醇二乙酸酯溶剂中。有关其他方法的详细信息，请参阅相应的 AOCS 方法。
Pro EZGC 模型
Restek 在线版本的 Pro EZGC 色谱图建模软件（www.Restek.com/proezgc）是一种选择性工具，依赖于预先加载的热力学保留指数库。生成了 Rxi-17Sil-MS 色谱柱的热力学保留指数。以下化合物用于生成保留指数：游离 3-MCPD、3-MCPD-d5、2-MCPD、2-MCPD-d5、缩水甘油酯和缩水甘油-d5酯。在分析之前，将游离的 3-MCPD、3-MCPD-d5、2-MCPD 和 2-MCPD-d5 溶解在乙酸乙酯中并用 PBA 衍生化。将缩水甘油酯和缩水甘油-d5酯分别转化游离的 3-MBPD 和 3-MBPD-d5，然后根据调整后的 AOCS 方法CD29B-13 用 PBA 衍生化。制备浓度为 50-100μg/mL 的 Pro EZGC 模型样品。使用软件探索方法的进一步优化机会Restek 的在线版 Pro EZGC 软件是一个选择性工具，它依赖于预先加载的热力学保留指数库。这使得预测保留时间和优化色谱
方法成为可能，同时无需在许多不同条件下分析化合物组。Pro EZGC 软件通过同时调节膜厚、温度、柱长、柱内径和流量来选择固定相。用户可以输入每个化合物或复制/粘贴大型化合物列表到程序中。
为了进一步优化 GC 方法，我们选择建立并使用了一个新的 Pro EZGC 库，该库主要针对水解和衍生化后的 MCPD 和缩水甘油酯。缩水甘油酯可以分析为 3-MCPD 或 3-MBPD，两者都在模型中。记住，如果您自己尝试这个，请一定要将柱出样口改为真空！Pro EZGC 工具提供的初始解决方案使用了一个升温阶数，并预测在 5 分钟多一点的时间内最后一种分析物(3-MBPD) 洗脱（使用 20m x 0.18mm x 0.18μm Rxi 17 Sil MS 色谱柱）。但是，我们希望保留两阶升温程序，因此我们使用相关工具 EZGC 方法转移器为原始方法选择了起点，然后使用 Pro EZGC 程序对其进行了进一步的改进。于是得到了一个新的、更快的 GC 温度程序，能够在 5 分钟内分析所有分析物（图 6）。
结论
在本文中，我们研究了优化策略，并开发了一种改进的间接 GC-MS 方法，用于分析 3-MCPD 和缩水甘油酯，其产生的峰形更好，同时不会对分辨率产生不利影响。经验优化的温度程序每次分析可节省 8 分钟，而使用 Pro EZGC 色谱图建模软件生成的方法可节省达 20 分钟。使用分流进样代替不分流进样对检测限没有负面影响，并且由于较少的衍生化试剂进入色谱柱，因此有可能延长色谱柱的使用寿命。选择常规分流/不分流进样口而不是 PTV 进样口对性能也没有负面影响；但是，建议使用保护柱。最后，使用 GC-MS/MS 大大提高了检测限。